Un ligando disociado del receptor de glucocorticoides atenúa el proceso autoinmune en un modelo de diabetes tipo 1 – XIX Congreso Argentino de Diabetes – Mar del Plata, Argentina – 2014
Resumen: Previamente, mostramos que el compuesto A (CpdA), ligando no esteroideo del receptor de glucocorticoides, retrasó la aparición de hiperglucemia, redujo la insulitis y previno la pérdida de la expresión de insulina en las células B en el modelo de transferencia adoptiva de diabetes autoinmune en ratones NODscid. In vitro, inhibió la expresión de T-bet y la secreción de citoquinas pro-inflamatorias en células del bazo de ratones NOD y previno la maduración fenotípica y funcional de células dendríticas (DCs) de ratones C57. En este trabajo, analizamos la respuesta a una sobrecarga de glucosa en los animales transferidos adoptivamente y evaluamos su sensibilidad a la insulina, exploramos la capacidad de las DCs tratadas con CpdA de inducir una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada, característica del perfil Th1 y evaluamos la acción de esta droga sobre las DCs de ratones NOD. Además, estudiamos la activación del clon BDC2.5 luego del tratamiento de los ratones transgénicos NOD BDC2.5 con el CpdA. Encontramos que la respuesta a insulina de los ratones transferidos adoptivamente y tratados con CpdA no difirió significativamente la de los ratones control, indicando que el CpdA no induciría resistencia a esta hormona. Por otro lado, luego de 100 días de tratamiento, el área bajo la curva de glucemia vs tiempo en respuesta a una sobrecarga de glucosa de los ratones transferidos adoptivamente y tratados con CpdA fue inferior a la de los controles diabéticos y superior a la de los normales, indicando cierto grado de pérdida de funcionalidad de las células B. El tratamiento con CpdA redujo significativamente la capacidad de las DCs de inducir una respuesta inmune adaptativa in vivo. Además, previno la expresión de importantes moléculas co-estimulatorias y la secreción de IL12 (p70) y TNFalfa por las DCs de ratones NOD, indicando que en esta cepa también prevendría la maduración fenotípica y funcional de las DCs. No detectamos diferencias significativas en la activación in vitro, antígeno específica, del clon BDC2.5 entre los animales tratados con CpdA y controles. Esto indicaría que el tratamiento con CpdA por un corto período, previo al desarrollo de autoinmunidad, no prevendría la futura activación del clon diabetogénico BDC2.5. En conjunto con nuestros resultados previos, concluimos que el CpdA tendría valor terapéutico como inmunosupresor para el tratamiento de la diabetes autoinmune en etapas de la enfermedad previas a la aparición de hiperglucemia.
Nueva población de células madre humanas con capacidad inmunoreguladora. Potencial empleo como terapia celular en la diabetes autoinmune. – XIX Congreso Argentino de Diabetes – Mar del Plata, Argentina – 2014
Resumen: Introducción. Recientemente, ha sido descripta una nueva población de células madre pluripotentes denominadas Muse (multilineage differentiating stress enduring). Aún, no se conoce si estas células poseen actividad inmunomoduladora y/o regenerativa en el contexto de la diabetes autoinmune. La diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune en la que existe muerte de células β mediada por linfocitos T. Objetivos. 1) optimizar las condiciones de aislamiento y caracterización de células Muse derivadas de tejido adiposo humano; 2) evaluar su capacidad inmunomoduladora empleando un clon diabetogénico murino de linfocitos T-CD4+. Materiales y Métodos. Aislamiento de células Muse de tejido adiposo humano proveniente de cirugía por liposucción mediante digestión con Colagenasa en condiciones de estrés celular. Las células Muse se cultivaron en DMEM 20%FCS/antibióticos durante 10-14 días. La caracterización fenotípica se realizó mediante citometría de flujo. Inmunofluorescencia seguido de microscopía confocal para la determinación de marcadores de pluripotencia. Se cultivaron esplenocitos de ratones transgénicos para el receptor T en linfocitos CD4+ (ratón NOD.BDC2.5) que reconoce un Ag diabetogénico específico. Se emplearon ratones NODscid para realizar el ensayo de teratogénesis. Se cuantificó mINF mediante ELISA. Resultados. Se obtuvieron 2-3×105 Muse/g tejido adiposo. Las células Muse expresaron los factores de pluripotencialidad: Sox2, Oct4, Nanog, SSEA-3/4, TRA1-60, y fueron positivas para los clusters de diferenciación: CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 y negativas para: CD34, CD45, HLA-DR. No formaron teratomas luego de la inyección intratesticular (106 Muse) durante el periodo estudiado (30; 60; 90 y 180 días). El medio condicionado (72h) de células Muse disminuyó la secreción Ag específica de mINF-gamma de linfocitos T-CD4+ (699 % vs control, p<0.001) y este no afectó la proliferación celular T. Conclusión. Por las propiedades de las células Muse aquí descriptas: facilidad de obtención a partir de tejido de descarte, bioseguridad y capacidad inmunoreguladora de linfocitos T diabetogénicos, proponemos que estas merecen ser estudiadas en una fase pre-clínica para determinar su factibilidad en el tratamiento de la T1DM.
Efecto de la activación colinérgica sobre la agregación celular y la formación de esferoides en cultivos tridimensionales de células de mama humana – LVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica – Mar del Plata, Argentina – 2013
Resumen: Demostramos que los receptores muscarínicos (RM) se sobreexpresan en células tumorales MCF-7 derivadas de un adenocarcinoma mamario humano estrógeno-dependiente, mientras que están ausentes en células no tumorigénicas mamarias humanas MCF-10A. La activación de los RM promueve la progresión tumoral. Para determinar el rol de los RM en la oncogénesis mamaria, transfectamos establemente células MCF-10A y obtuvimos 3 clones, que expresan diferentes subtipos de RM: M3, M4 o M3-M4 (MCF-10A-M). Utilizando como modelo el cultivo tridimensional (esferoides) (volumen en mm3±DS) in vitro que simula las primeras etapas del crecimiento de tumores sólidos in vivo y comparamos la capacidad de agregación celular y el crecimiento tridimensional de los clones mencionados con el de las células MCF-7 que expresan receptores M3 y M4. Se observó que la línea celular MCF-10A (control) formó inicialmente agregados celulares laxos que sobrevivieron menos de 5 días en cultivo, sin formar esferoides. Las células MCF-7 formaron agregados y el tratamiento con el agonista colinérgico carbacol (CARB 10-9M) incrementó la sobrevida celular hasta el día 20 e indujo la formación de estructuras tridimensionales irregulares. Las células MCF-10A-M3-M4 formaron agregados que sobrevivieron en cultivo hasta el día 30. El tratamiento con CARB indujo la formación temprana de esferoides con un alto índice de compactación que sobrevivieron hasta el día 30 en cultivo (0.167±0.06). Las células MCF-10A-M4 formaron agregados celulares compactos y a los 15 días en cultivo formaron esferoides; el tratamiento con CARB incrementó el tamaño de los esferoides (0.18±0.058) con respecto al control (0.11±0.06) (n=5). Las células MCF-10A-M3 formaron agregados celulares laxos que sobrevivieron hasta el día 16 en cultivo; el CARB se indujo la formación de esferoides después de 15 días en cultivo que sobrevivieron hasta el día 30 en cultivo (0.12±0.06). Concluimos que la presencia del receptor M4 en las células transfectadas es una condición suficiente para la formación de esferoides, mientras que la estimulación con CARB potencia la formación y el crecimiento de esferoides en las células transfectadas en comparación con el control.
Role of muscarinic activation in regulation of human dendritic cells maturation process – 15th International Congress of Immunology – Milano, Italia – 2013
Abstract: We demonstrated the presence of muscarínic receptors M3, M4 and M5 receptors, and choline acetyltransferase and acetylcholinesterase enzymes in human dendritic cells (DC). Given that the maturation process of the DC has a central role in the immune response, we investigated the effect of cholinergic stimulation on the expression of maturation markers and the proinflammatory cytokines. DC were differentiated from positive selected CD14+ cells isolated from peripheral blood mononuclear cells and cultured with IL-4 and GM-CSF. Then cells were treated with the cholinergic agonist carbachol (Carb,10-8M) for 1h followed by additional 24h in the absence (immature(iDC)) or presence (mature(mDC)) of LPS (0.5mg/ml). We observed that Carb increased the expression of HLA-DR and CD86, as well as the production of IL-12 (Carb:575±10; baseline:374±15(pg/ml)) and TNF-α (Carb:6733±1167, baseline:3667±629) in mDC (n=3, P≤0.01). Both effects were reduced in the presence of the muscarinic antagonist atropine (10-7M). Nitric oxide synthase (NOS) isoforms are involved in the signaling pathway of M3 and M5 receptors and their product, nitric oxide, is an inflammatory mediator and an immune response regulator. We have shown by Western blot that iDC as well as mDC expressed NOS1 and NOS3 and had similar basal release of NO2-(uM) (iDC:2.99±0.96; mDC:1.98±0.51). Carb treatment increased the levels of NO2- in iDC. We concluded that cholinergic stimulation regulates the expression of phenotypic markers of maturation and production of proinflammatory cytokines in human DC. iDC also respond to the cholinergic agonist, increasing their nitric oxide production, which could be a key factor in the maturation process.
